ISOLASI DAN PEMURNIAN TERPENOID

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI TERPENOID

Ekstraksi senyawa terpenoid dilakukan dengan dua cara yaitu: melalui sokletasi dan maserasi. Sokletasi dilakukan dengan melakukan disokletasi pada serbuk kering yang akan diuji dengan 5L n-hexana. Ekstrak n-hexana dipekatkan lalu disabunkan dalam 50 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktifitas bakteri. Teknik maserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipekatkan lalu dihidriolisis dalam 100 mL HCl 4M. Hasil hidrolisis diekstraksi dengan 5 x 50 mL n-heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 10 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas bakteri. Uji aktivitas bakteri dilakukan dengan pembiakan bakteri dengan menggunakan jarum ose yang dilakukan secara aseptis. Lalu dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 2mL Meller-Hinton broth kemudian bakteri homogen diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C. Suspensi baketri homogeny yang telah diinkubasi siap dioleskan pada permukaan media Mueller-Hinton agar secara merata dengan menggunakan lidi kapas yang steril. Kemudian tempelkan disk yang berisi sampel, standar tetrasiklin serta pelarutnya yang digunakan sebagai kontrol. Lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C. Dilakukan pengukuran daya hambat zat terhadap baketri.

Uji fitokimia dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi Lieberman-Burchard. Perekasi Lebermann-Burchard merupakan campuran antara asam setat anhidrat dan asam sulfat pekat. Alasan digunakannya asam asetat anhidrat adalah untuk membentuk turunan asetil dari steroid yang akan membentuk turunan asetil didalam kloroform. Alasan penggunaan kloroform adalah karena golongan senyawa ini paling larut baik didalam pelarut ini dan yang paling prinsipil adalah tidak mengandung molekul air. Jika dalam larutan uji terdapat molekul air maka asam asetat anhidrat akan berubah menjadi asam asetat sebelum reaksi berjalan dan turunan asetil tidak akan terbentuk. 

Pemurniaan / Purification 

Proses pemisahan dan pemurnian bertujuan untuk mendapatkan senyawa murni dari fraksi yang ada. Dimana dalam hal ini difokuskan pada pemisahan dan pemurnian fraksi senyawa n-heksana saja.  Dalam proses pemisahan dan pemurnian ini di lakukan dengan metode kromatografi kolom tetapi sebelum analisis dilakukan, terlebih dahulu analisis dilakukan dengan kromatografi lapis tipis.

Pemisahan pertama dilakukan dengan menggunakan KVC, pelarut yang digunakan merupakan pelarut organik yang ditingkatkan kepolarannya secara gradien. Pada pemisahan ini digunakan pelarut n-heksan dan etil asetat. Berdasarkan analisa kromatogram KLT fraksi heksana pada eluen heksana dan etil asetat dengan beberapa komposisi perbandingan maka KVC dilakukan dengan beberapa perbandingan yaitu 100% n-heksan sebanyak 2 kali :24:1 sebanyak 3 kali : 21 : 4 sebanyak 4 kali ; 18:7 sebanyak 2 kali; 15 :10 sebanyak 2 kali ; 9:16 sebanyak 2 kali; 6:19 sebanyak 2 kali; 3:22 sebanyak 2 kali dan 100% asetat sebanyak 2 kali dengan volume 50 mL setiap kali elusi. KVC fraksi heksan dengan massa 4,1 gram menghasilkan 22 fraksi.

Fraksi yang memiliki pola kromatogram yang sama digabungkan hingga mendapatkan 5 fraksi gabungan. Massa dari masing-masing fraksi tersebut adalah fraksi A (1-4) sebanyak 838 mg, fraksi B (5) sebanyak 1.082 mg, fraksi C (6-7) sebanyak 1.017 mg, fraksi D dan E (8-17) sebanyak 82 mg dan fraksi F (128-22) sebanyak 91 mg. Fraksi-fraksi gabungan dianalisis dengan KLT menggunakan eluen heksana : etil asetat dengan perbandingan 6 : 4.

Analisa kromatogram 24 fraksi yang diperoleh dari hasil KVC dapat digabungkan berdasarkan kesamaan Rf menjadi 8 fraksi. Massa masing-masing fraksi tersebut adalah fraksi C1 (1-6) sebanyak 15 mg, C7 (7) sebanyak 15 mg, C2 (8-10) sebanyak 126 mg, C11 ( 11)sebanyak 117 mg, C3 (12-14) sebanyak 149 mg, C4 (15-19) sebanyak 188 mg, C20 (20) sebanyak 59 mg dan C5 (21-24) sebanyak 207 mg.

Hasil penggabungan fraksi dalam C2 dan C11 berbentuk kristal. Rekristalisasi dilakukan dengan melarutkan fraksi kristal dengan metanol panas yang kemudian didinginkan. Setelah didinginkan terbentuk kristal yang tidak larut di dialam metanol. Kristal tersebut dipisahkan dengan menggunkan kertas saring. Dengan menggunakan teknik pemurnian rekristalisasi pada kedua difraksi tersebut didapat beberapa fraksi kristal. Fraksi- fraksi  tersebut diuji kemurniannya dengan KLT dan dilihat pula kromtogramnya untuk mengetahui senyawa yang sama atau tidak pada hasil kemurnian dengan rekristalisasi tersebut. Dari fraksi-fraksi hasil diperoleh fraksi murni yakni C2 – 1 dan C11-2. Hasil rekritalisasi kedua fraksi tersebut kemudian dianalisis dengan menggunakan FT-IR dan NMR.[3]

Permasalahan : Mengapa pada proses sokletasi, ekstrak n-heksana yang digunakan dipekatkan dan kemudian disabunkan dalam 50ml KOH 10% sedangkan pada maserasi menggunakan ekstrak metanol juga dipekatkan dan kemudian baru dilakukan uji fitokimia dan uji aktifitas bakteri ? bagaimana pengaruh pengentalan ekstrak n-heksana dan metanol tersebut pada uji fitokimia dan uji aktifitas bakteri ?

---

BIOSINTESIS TERPENOID

Terdapat banyak tumbuhan yang memiliki bau yang harum dan bau harum tersebut berasal dari senyawa yang terdiri dari 10 dan 15 karbon yang disebut terpen. Golongan senyawa ini dapat dipisahkan melalui distilasi uap atau ekstraksi yang dikenal dengan minyak atsiri.

Pada tahun 1877 Wallach yang dikenal dengan hukum isopern mengemukakan bahwa semua komponen minyak atsiri dapat dianggap berasal dari struktur sederhana yang disebut isopern atau 2-metil-1,3-butadien (C₅H₈). Selain itu juga terbukti bahwa minyak atsiri merupakan kelipatan dari C₅H₈.

 

Biosintesa Senyawa Terpenoida

Secara umum biosintesa terpenoida dengan terjadinya 3 reaksi dasar yaitu:

1.      Pembentukan isoprena aktif berasal dari asam asetat melalui asam mevalonat. Asam asetat setelah diaktifkan oleh koenzim A (Ko-A) melakukan kondensasi jenis Claisen menghasilkan Asetoasetil Ko-A. Senyawa ini dengan Asetil Ko-A melakukan kondensasi jenis Aldol menghasilkan rantai karbon bercabang sebagaimana ditemukan pada asam mevalonat.

 

 

2. Penggabungan kepala dan ekor dua unit isoprena akan membentuk mono-, seskui-, di-, sester-, dan poli- terpenoida.

Setelah asam mevalonat terbentuk, reaksi-reaksi berikutnya adalah fosforilasi, eliminasi asam posfat, dan dekarboksilasi menghasilkan Isopentenil Pirofosfat (IPP). Selanjutnya berisomerisasi menjadi Dimetil Alil Pirofosfat (DMAPP) oleh enzim isomerase. IPP inilah yang bergabung dari kepala ke ekor dengan DMAPP. Penggabungan ini terjadi karena serangan elektron dari ikatan rangkap IPP terhadap atom karbon dari DMAPP yang kekurangan elektron diikuti oleh penyingkiran ion pirofosfat mengasilkan Geranil Pirofosfat (GPP) yaitu senyawa antara bagi semua senyawa monoterpenoida. Penggabungan selanjutnya antara satu unit IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama menghasilkan Farnesil Pirofosfat (FPP) yang merupakan senyawa antara bagi semua senyawa seskuiterpenoida. Senyawa diterpenoida diturunkan dari Geranil – Geranil Pirofosfat (GGPP) yang berasal dari kondensasi antara satu uni IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama.

 

3. Penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau unit C-20 menghasilkan triterpenoida dan steroida.

Triterpenoida (C30) dan tetraterpenoida (C40) berasal dari dimerisasi C15 atau C20 dan bukan dari polimerisasi terus-menerus dari unit C-5. Yang banyak diketahui ialah dimerisasi FPP menjadi skualena yang merupakan triterpenoida dasar dan sumber dari triterpenoida lainnya dan steroida. Siklisasi dari skualena menghasilkan tetrasiklis triterpenoida lanosterol.( Pinder, 1960).

  

permasalahan : berdasarkan penjelasan diatas bahwa triterpenoida dan tetraterpenoida bukan dari polimerisasi terus menerus dari unit C-5. Mengapa hal tersebut terjadi ? adakah kemungkinan triterpenoida dan tetraterpenoida dapat dihasilkan memlalui polimerisasi terus menerus dari unit C-5 ?